Uchiha Itachi chết ở chương 393 của manga và ở tập 138 của anime "Naruto Shippuden".

Itachi trước giờ cố gắng tỏ ra mạnh mẽ nhưng thực ra sức khỏe anh đang dần dần hao mòn vì bệnh tật (bị thổ huyết) cộng thêm sự đau khổ trong tinh thần và vết thương từ các cuộc chiến, thậm chí anh phải dùng tới thuốc để duy trì mạng sống.

Itachi hẹn Sasuke đến mật thất dòng họ Uchiha để quyết đấu một trận cuối cùng. Khi nhắc lại tất cả những gì đã qua, Itachi luôn làm bộ mặt kẻ sát nhân, tỏ ra thèm khát cặp mắt Sharingan của Sasuke. Hai anh em trải qua một trận chiến thật sự, có thể nói là ngang tài ngang sức. Cùng lúc đó, Orochimaru từ trong dấu bùa chúa trên cổ Sasuke xuất hiện, biến thành một con rắn 8 đầu khổng lồ, Itachi dùng thanh kiếm Totsuka đâm xuyên vào người Orochimaru, giam cầm hắn vĩnh viễn và giải thoát Sasuke khỏi hắn.

Itachi lúc này bắt đầu yếu đi, Susanoo của anh cũng bị giảm dần, anh thổ huyết rất nhiều mà vẫn gượng tiến đến Sasuke, Sasuke tưởng rằng anh muốn lấy đôi mắt của mình nên đã sử dụng nhiều Kunai và bùa nổ để tấn công, nhưng nhờ Susanoo anh vẫn tiếp tục lại gần Sasuke. Tuy nhiên anh không lấy đi đôi mắt Sharingan. Itachi chỉ dùng tay ấn nhẹ lên trán em mình như ngày xưa (mục đích để truyền hết nhãn lực cho cậu), mỉm cười: "Anh xin lỗi Sasuke, sẽ không còn lần sau nữa rồi." Và Itachi gục xuống, để lại Sasuke lặng thinh, sững sờ. Cậu cũng nhanh chóng ngã quỵ bên cạnh xác anh mình vì kiệt sức.

Từ chương 396 - 400 của manga, Sasuke được Tobi của tổ chức Akatsuki cứu sống và thuật lại câu chuyện bị che giấu về Itachi trong vụ thảm sát gia tộc Uchiha. Tobi tự xưng là Uchiha Madara, thủ lĩnh đầu tiên của dòng tộc Uchiha nhưng thực ra hắn là Uchiha Obito, bạn cũ của Hatake Kakashi và học trò của Hokage Đệ tứ Namikaze Minato (cha của Naruto). Qua lời kể của Tobi, Sasuke biết được tất cả sự thật về anh trai. Tobi nói Itachi làm tất cả chỉ vì bảo vệ cho cậu, tới khi chết rồi vẫn một lòng nghĩ tới cậu. Mặc dù Sasuke cố gắng phủ nhận điều đó nhưng rốt cuộc vẫn phải tin. Sharingan của Sasuke đạt đến đỉnh điểm nhờ năng lực từ anh trai. Qua cái chết của người thân duy nhất còn lại, cậu đã đánh thức Mangekyo Sharingan của riêng mình. Sau khi nghe hết câu chuyện của Tobi, Sasuke ra đứng lặng lẽ trên mỏm đá cạnh bờ biển, nhớ về thời thơ ấu và bật khóc nức nở khi hồi tưởng lại nụ cười trước khi ra đi của Itachi. Mục tiêu của cậu bấy giờ chỉ có một: Tiêu diệt làng Lá.

Itachi đã chết theo đúng số phận mà anh lựa chọn, chết dưới tay em trai yêu quý. Tobi bảo rằng đối với Itachi, mạng sống của Sasuke còn quan trọng hơn cả làng Lá. Con người của Itachi đến phút cuối vẫn còn là một ẩn số lớn. Anh "quá tài giỏi để hòa nhập, quá tàn nhẫn để chung sống và quá mâu thuẫn để hiểu rõ chính bản thân mình". Itachi từng nghĩ sự thật về cuộc thảm sát gia tộc Uchiha sẽ được chôn vùi sau khi anh chết, nhưng Uchiha Obito đã tiết lộ mọi thứ cho Sasuke, khiến kế hoạch của anh thất bại. Vốn là người khôn ngoan và khó lường, Itachi đã tính trước các phương án dự phòng, một trong số đó là con quạ mà anh đã cấy vào người Naruto.

Sau này, trong trận đại chiến gần cuối truyện, Yakushi Kabuto đã dùng cấm thuật Tạp giới Chuyển sinh (Edo Tensei), hồi sinh nhóm Akatsuki, những Kage tiền nhiệm, những cựu Jinchuuriki và tất cả các ninja đã chết từ trước tới nay, khống chế họ chống lại liên minh Ngũ đại Kage. Itachi khi được hồi sinh đã đi tìm Naruto, bắt đầu dùng đến con quạ mà anh trao cho Naruto ngày xưa, nó chứa con mắt Sharingan từ người bạn thân nhất của anh - Uchiha Shisui. Con mắt này ẩn chứa ảo thuật cực mạnh mang mệnh lệnh "bảo vệ làng Lá", giúp triệt tiêu cấm thuật Tạp giới Chuyển sinh lên Itachi, giải thoát anh khỏi sự khống chế của Kabuto. Nhờ vậy, anh, Naruto và Killer Bee (Ong Sát Thủ - Bát Vĩ) mới phong ấn thành công Nagato. Sau đó, Itachi giao cho Naruto nhiệm vụ giúp mọi người ngăn chặn các thây ma bị triệu hồi, còn anh sẽ phá giải cấm thuật. Trên đường tới chỗ Kabuto, anh gặp lại Sasuke, hai anh em hợp lực tiêu diệt Kabuto và giam cầm hắn vào ảo thuật Izanami vĩnh hằng, ra lệnh cho hắn giải Tạp giới Chuyển sinh. Sau khi diệt được Kabuto, anh kể cho Sasuke sự thật còn sót lại về bi kịch thảm sát gia tộc Uchiha. Itachi chết một lần nữa sau khi cấm thuật được hóa giải, những người bị triệu hồi cùng với anh cũng biến mất hoàn toàn. Trước lúc ra đi thực sự, Itachi cụm đầu mình vào Sasuke thay vì ấn nhẹ lên trán cậu như hồi còn nhỏ, đồng nghĩa với việc anh không còn coi cậu là trẻ con nữa mà đã là một người trưởng thành. Anh trăn trối với Sasuke rằng dù cậu có lựa chọn trở thành người thế nào, anh vẫn mãi mãi yêu thương cậu. Nói xong lời cuối cùng, thể xác hồi sinh của Itachi tan vỡ, linh hồn anh trở về thế giới bên kia.